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SIM實驗——SIM生化管
操作步驟: 挑取菌苔穿刺接種于SIM培養(yǎng)基中,穿刺接種約1/2深度;用相同的方法接種福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌、單增李斯特氏菌,之后放置于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24h。 結(jié)果觀察: 1.接種福氏志賀氏菌的試管穿刺線清晰,未擴(kuò)散,說明該菌無鞭毛,無動力; 2.接種鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特氏菌、大腸埃希氏菌穿刺線周圍有明顯的擴(kuò)散現(xiàn)象,說明這類菌有鞭毛,有動力。 3.接種鼠傷寒沙門氏菌的試管變黑,其他試管無變黑,這是因為某些細(xì)菌能分解含硫氨基酸,生成硫化氫,硫化氫和培養(yǎng)基中的鐵鹽反應(yīng)生成黑色的硫化亞鐵沉淀。 然后再滴加Kovacs靛基質(zhì)試劑2-4滴于培養(yǎng)基表面,靜置10min,觀察試驗結(jié)果: 1.接種大腸埃希氏菌的試管上層有變紅,這是因為該菌能分解色氨酸,生成吲哚,吲哚與Kovacs靛基質(zhì)試劑中的對二甲基氨基苯醛結(jié)合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。 2.接種福氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特氏菌無變紅現(xiàn)象。
  
OF生化管實驗
操作步驟: 1.用接種環(huán)蘸取純培養(yǎng)物,同時穿刺接種兩只生化管。 2. 其中一只生化管加蓋1cm后的滅菌液體石蠟,另一只不加。 3. 將兩只接種菌株的生化管用封口膜包裹封口。 4. 36?1℃培養(yǎng)18-24h后觀察試驗結(jié)果。 實驗結(jié)果判斷: 1. 大腸桿菌為發(fā)酵型細(xì)菌,在有氧或無氧環(huán)境中都能分解葡萄糖產(chǎn)酸,所以兩支生化管均變黃。 2. 銅綠假單胞菌為氧化型細(xì)菌,在無氧環(huán)境中不能分解葡萄糖,所以加蓋石蠟的生化管不變黃,而不加石蠟的生化管變黃。 3. 糞產(chǎn)堿桿菌為產(chǎn)堿型細(xì)菌不能分解葡萄糖,所以兩支生化管均不變黃。
  
MYP平板的制備——甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂基礎(chǔ)(MYP)
配制要點: 1、加入時需注意不斷搖晃錐形瓶,使試劑分布均勻。 2、加入卵黃時溫度一定不能太高,否則卵黃變性,培養(yǎng)基將無法使用。 3、倒平板時盡量不要太厚,否則將不容易觀察結(jié)果。 結(jié)果觀察: 蠟樣芽孢桿菌:菌落為微粉紅色,周圍有淡粉紅色沉淀環(huán);枯草芽孢桿菌:黃色菌落,無沉淀環(huán);大腸桿菌,被抑制,不生長。
  
MUG培養(yǎng)基實驗
操作步驟: 1.取細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物,用接種環(huán)接種于生理鹽水管中,振蕩混勻。 2.按照10倍系列稀釋法制備菌液,取接種量為10-100cfu的菌懸液,進(jìn)行試驗。 3. 用移液槍吸取100μL稀釋好的菌液接種到MUG培養(yǎng)基管中,接種兩個平行管,同時吸取100μL生理鹽水接種到MUG培養(yǎng)基管中作為空白對照。 4. 相同的方法接種其他菌株,之后放置于30-35℃培養(yǎng)5-24小時 結(jié)果觀察: 發(fā)現(xiàn)接種大腸埃希氏菌和陰溝腸桿菌的試管變渾濁。而接種金黃色葡萄球菌的試管為澄清狀態(tài)。 葡萄糖醛酸苷酶檢測: 在黑暗環(huán)境中,使用366nm紫外燈照射培養(yǎng)后的試管,發(fā)現(xiàn)接種兩株大腸埃希氏菌的試管均產(chǎn)生藍(lán)白色熒光,這是因為MUG的β-糖醛酸苷鍵被大腸埃希氏菌產(chǎn)生的葡萄糖醛酸苷酶水解,釋放出4-甲基傘形酮,4-甲基傘形酮在紫外燈下可產(chǎn)生藍(lán)白色熒光。 而接種陰溝腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)管無藍(lán)白色熒光,說明這兩株菌不能產(chǎn)生葡萄糖醛酸苷酶。 靛基質(zhì)試驗: 向培養(yǎng)后的試管滴加Kovacs靛基質(zhì)試劑2-3滴,立即觀察結(jié)果,也可以放置室溫5-10min觀察結(jié)果。發(fā)現(xiàn)接種兩株大腸埃希氏菌的試管均有紅色環(huán)產(chǎn)生,這是因為蛋白胨中的色氨酸被大腸埃希氏菌產(chǎn)生的色氨酸酶分解,形成靛基質(zhì)。靛基質(zhì)與Kovacs靛基質(zhì)試劑反應(yīng),形成紅紫色醌式化合物,即紅色環(huán)。 而陰溝腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)管有黃色環(huán),說明這兩株菌均不含有色氨酸酶。
  
MR-VP實驗——MR-VP 甲基紅試劑 vp試劑~1
操作步驟: 1.挑取實驗菌苔接種于生理鹽水管中,制備菌懸液,本實驗以大腸埃希氏菌、單增李斯特氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌為例,進(jìn)行實驗; 2.然后用移液槍吸取100ul菌懸液,接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中,每種菌接種2個試管; 3.之后放置于36℃培養(yǎng)24-48h。 MR實驗: 向試管中滴加3滴甲基紅試劑,觀察顏色變化,接種大腸桿菌和單增李斯特氏菌的試管變紅,為陽性反應(yīng);接種產(chǎn)氣腸桿菌的試管不變紅,為陰性反應(yīng)。 實驗原理:不同細(xì)菌分解葡萄糖的產(chǎn)物不同,大腸桿菌、單增李斯特氏菌可分解葡萄糖產(chǎn)生大量酸,使pH值下降到4.5以下,所以滴入甲基紅顯紅色; 產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)酸較少,所以滴入甲基紅顯橙黃色。 VP實驗: 另取試管,向試管中滴加V-P試劑A液(6%α-萘酚-乙醇溶液)9滴,B液(40%氫氧化鉀溶液)3滴,建議最低使用量為A液6滴、B液2滴。充分振蕩混勻,之后置于36?1℃培養(yǎng)0.5-4h。 培養(yǎng)結(jié)束后觀察結(jié)果,發(fā)現(xiàn)接種大腸桿菌的試管不變紅,為陰性反應(yīng);接種單增李斯特氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌的試管變紅,為陽性反應(yīng)。 實驗原理:產(chǎn)氣腸桿菌、單增李特氏菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,并使丙酮酸脫羧,生成中性的乙酰甲基甲醇,在堿性溶液中被空氣氧化生成二乙酰,繼續(xù)與培養(yǎng)基中的胍基反應(yīng)生成紅色化合物,即為V-P陽性。
  
IMVic實驗——大腸埃希氏菌生化鑒定條~3
什么是IMViC試驗? IMViC試驗是一項重要的腸桿菌科生化實驗,此實驗包括四個生化, I :indol 靛基質(zhì)(吲哚)試驗 M: Methyl red 甲基紅試驗 V:Voges-Prokauer VP試驗 C: Citeate utilization 西蒙氏檸檬酸鹽利用試驗 操作步驟: 第一步:制備菌懸液 挑取一環(huán)待測菌的菌懸液,接種于生理鹽水管中,用旋渦混合器振蕩混勻,制成均一的細(xì)菌懸液; 第二步:接種菌液至生化鑒定條 用酒精棉擦拭鑒定條表面及打孔器,之后依次打孔, 用移液槍吸取菌液,依次加入每個孔中,每孔100ul, 之后置于36℃?1℃培養(yǎng)24h。 第三步:滴加試劑,觀察結(jié)果 第1孔滴加靛基質(zhì)試劑1-2滴 第2孔滴加甲基紅試劑2-3滴 第3孔滴加VP試劑A液3滴,VP試劑B液1滴 結(jié)果觀察: 大腸埃希氏菌ATCC25922的生化特征為: 靛基質(zhì)陽性,有玫紅色環(huán) 甲基紅陽性,顯紅色 VP試劑陰性,不變紅 (VP試劑滴加后,需20分鐘后再觀察結(jié)果,如為變紅色需延長至4h觀察結(jié)果,如仍未變紅色才可判定為陰性) 西蒙氏檸檬酸鹽陰性,不變藍(lán)
  
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